分子熒光光譜法實(shí)驗報告范文

　　一、 實(shí)驗目的

　　1.掌握熒光光度計的基本原理及使用。

　　2.了解熒光分光光度計的構造和各組成部分的作用。

　　3.掌握分子熒光光度計分析物質(zhì)的特征熒光光譜：激發(fā)光譜、發(fā)射光譜的測定方法。

　　4.了解影響熒光產(chǎn)生的幾個(gè)主要因素。

　　5.學(xué)會(huì )運用分子熒光光譜法對物質(zhì)進(jìn)行定性和定量分析。

　　二、 實(shí)驗原理

　　原子外層電子吸收光子后，由基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)，再回到較低能級或者基態(tài)時(shí)，發(fā)射出一定波長(cháng)的輻射，稱(chēng)為原子熒光。對于分子的能級激發(fā)態(tài)稱(chēng)為分子熒光，平時(shí)所說(shuō)的熒光指分子熒光。

　　具有不飽和基團的基態(tài)分子經(jīng)光照射后，價(jià)電子躍遷產(chǎn)生熒光，是當電子從第一激發(fā)單重態(tài)S1的最低振動(dòng)能級回到基態(tài)S0各振動(dòng)能級所產(chǎn)生的光輻射。

　　(1)激發(fā)光譜

　　是指發(fā)光的`某一譜線(xiàn)或譜帶的強度隨激發(fā)光波長(cháng)(或頻率)變化的曲線(xiàn)。橫坐標為激發(fā)光波長(cháng)，縱坐標為發(fā)光相對強度。

　　激發(fā)光譜反映不同波長(cháng)的光激發(fā)材料產(chǎn)生發(fā)光的效果。即表示發(fā)光的某一譜線(xiàn)或譜帶可以被什么波長(cháng)的光激發(fā)、激發(fā)的本領(lǐng)是高還是低；也表示用不同波長(cháng)的光激發(fā)材料時(shí)，使材料發(fā)出某一波長(cháng)光的效率。熒光為光致發(fā)光，合適的激發(fā)光波長(cháng)需根據激發(fā)光譜確定——激發(fā)光譜是在固定熒光波長(cháng)下，測量熒光體的熒光強度隨激發(fā)波長(cháng)變化的光譜。獲得方法：先把第二單色器的波長(cháng)固定，使測定的λem不變，改變第一單色器波長(cháng)，讓不同波長(cháng)的光照在熒光物質(zhì)上，測定它的熒光強度，以I為縱坐標，λex為橫坐標所得圖譜即熒光物質(zhì)的激發(fā)光譜，從曲線(xiàn)上找出λex，，實(shí)際上選波長(cháng)較長(cháng)的高波長(cháng)峰。

　　(2)發(fā)射光譜

　　是指發(fā)光的能量按波長(cháng)或頻率的分布。通常實(shí)驗測量的是發(fā)光的相對能量。發(fā)射光譜中，橫坐標為波長(cháng)（或頻率），縱坐標為發(fā)光相對強度。

　　發(fā)射光譜常分為帶譜和線(xiàn)譜，有時(shí)也會(huì )出現既有帶譜、又有線(xiàn)譜的情況。 發(fā)射光譜的獲得方法：先把第一單色器的波長(cháng)固定，使激發(fā)的λex不變，改變第二單色器波長(cháng)，讓不同波長(cháng)的光掃描，測定它的發(fā)光強度，以I為縱坐標，λem為橫坐標得圖譜即熒光物質(zhì)的發(fā)射光譜;從曲線(xiàn)上找出最大的λem。

　　(3)熒光強度與熒光物質(zhì)濃度的關(guān)系

　　用強度為I0的入射光，照射到液池內的熒光物質(zhì)時(shí)，產(chǎn)生熒光，熒光強度If用儀器測得，在熒光濃度很稀(A<0.05)時(shí)，熒光物質(zhì)發(fā)射的熒光強度If與濃度有下面的關(guān)系：If=KC。

　　三、 實(shí)驗試劑和儀器

　　試劑：羅丹明B乙醇溶液；1-萘酚乙醇溶液；3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide：標準溶液，10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度；蒸餾水；乙

　　醇。

　　儀器：Fluoromax-4熒光分光光度計；1cm比色皿；spectrofluorometer分析軟件。

　　熒光分析儀器結構：它主要由光源、單色器、液槽、檢測器和顯示器組成。光源發(fā)出的紫外-可見(jiàn)或者紅外光經(jīng)過(guò)激發(fā)單色器分光后，照到熒光池中的被檢測樣品上，樣品收到該激發(fā)光照射后，發(fā)出的熒光經(jīng)發(fā)射單色器分光，由光電倍增管轉換成相應電信號，再經(jīng)放大器放大反饋進(jìn)入轉換單元，將模擬電信號轉換成相應數字信號，并通過(guò)顯示器或打印機顯示和記錄被測樣品譜圖。

　　四、 實(shí)驗步驟

　　1.樣品制備。配置不同濃度的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide溶液，分別為10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml和未知濃度。

　　2.打開(kāi)熒光分光光度計和電腦，預熱半個(gè)小時(shí)。

　　3.打開(kāi)spectrofluorometer分析軟件，進(jìn)行相關(guān)參數的設置。首先檢測羅丹明B的激發(fā)光譜，此時(shí)固定發(fā)射波長(cháng)為560nm，檢測并保存激發(fā)光譜。然后根據所檢測的激發(fā)光譜中的最大峰值541nm來(lái)設置檢測羅丹明B的熒光光譜的激發(fā)波長(cháng)，檢測并保存所得的熒光光譜。

　　4.檢測1-萘酚的熒光光譜。方法同步驟3。

　　5.用已配置好的3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide標準溶液進(jìn)行與2中相同的步驟，找到最大激發(fā)波長(cháng)與最大發(fā)射波長(cháng)，之后選定單點(diǎn)檢測模式，并設置成剛選擇的最大激發(fā)波長(cháng)與最大發(fā)射波長(cháng)，分別對10μg/ml, 20μg/ml,30μg/ml,40μg/ml進(jìn)行檢測，記錄數據，繪制工作曲線(xiàn)。

　　6.對未知濃度3,3’-Diethyloxadicarbocyanine iodide進(jìn)行檢測，記錄數據，并根據工作曲線(xiàn)求出濃度。

　　五、 數據記錄和處理

　　1． 數據記錄

　　(1)羅丹明B的測定

　　圖2.羅丹明B的激發(fā)光譜

　　圖3.羅丹明B的熒光光譜

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